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我正在处理单细胞测序数据，并希望通过 RNA 速度 ( https://www.nature.com/articles/s41586-018-0414-6 ) 运行它。为此，我需要映射拼接和未拼接的读取。我正在使用的数据集是 SMARTseq 数据集，没有 UMI 或条形码（https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2018100164）。数据作为每个单元格的单个 sra 文件提供，可以使用 SRAtoolkit 通过 GEO 获取并解压缩到单端 fastq 文件中。

我的目标是使用 STAR 对齐将数据映射两次。首先，我想将读数映射到外显子区域，然后再映射到内含子区域。为此，我从 ensembl 参考基因组 GRCm38 build 100 ( https://www.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index ) 下载了 fasta 和 gtf 文件。gtf 文件本身不包含 intronic 信息，我使用以下代码在 R 中添加了这些信息：

library(gread) # https://rdrr.io/github/asrinivasan-oa/gread/
library(rtracklayer)

dir <- "/to/reference/genome"
gtf_file <- file.path(dir, "GRCm38build100.gtf")
gtf <- read_format(gtf_file)
gtf.new <- construct_introns(gtf, update = TRUE)[]
export(gtf.new, "GRCm38build100withIntrons.gtf", format = "gtf")

然后，我生成了一个 STAR 基因组，如下所示：

STAR \
--runMode genomeGenerate \
--runThreadN 8 \
--sjdbOverhang 50 \
--genomeDir GRCm38build100/50bp/ \
--genomeFastaFiles GRCm38build100/GRCm38build100.fa \
--sjdbGTFfile GRCm38build100/GRCm38build100withIntrons.gtf \

针对外显子序列映射读取的代码如下：

STAR \
--runMode alignReads \
--runThreadN 8 \
--genomeDir GRCm38build100/50bp \
--readFilesIn $R1 \
--outSAMtype None \
--twopassMode Basic \
--sjdbGTFfeatureExon exon \
--quantMode GeneCounts \
--outFileNamePrefix output/${SAMPLE}_exon_

这工作得很好。对于未拼接的读取，我想做以下事情：

STAR \
--runMode alignReads \
--runThreadN 8 \
--genomeDir GRCm38build100/50bp \
--readFilesIn $R1 \
--outSAMtype None \
--twopassMode Basic \
--sjdbGTFfeatureExon intron \
--quantMode GeneCounts \
--outFileNamePrefix output/${SAMPLE}_intron_

奇怪的是，这给了我与外显子读取映射完全相同的结果。我很困惑，我确定我做错了什么，但我不知道是什么。任何帮助将非常感激！

最好的问候，莱昂

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