threshold - 使用 ImageJ 测量强度

Question

我们必须使用 imagej 测量图像某些区域的荧光强度。我们提出了以下步骤来测量强度。虽然看起来确实正确，但我的问题是——>我们实际上是使用以下步骤正确测量强度，还是我们错误地测量了其他东西并认为该值就是强度？

1. 将图像设为 8 位
2. 对图像设置阈值（图像 > 调整 > 阈值）以勾勒出所有区域，然后单击应用
3. 打开分析 > 分析粒子。确保单击“添加到管理器”
4. 分析 > 分析粒子 > 显示 > 裸轮廓。这将打开一个新图像。
5. 打开彩色显微镜图像。然后，图像 > 叠加 > 从 ROI 管理器。
6. 图像 > 叠加 > 到 ROI 管理器。
7. 在 ROI Manager 中：按“测量”。（将弹出带有单个数据点的结果窗口）
8. 在结果窗口中单击鼠标右键，然后单击汇总。
9. 记录平均强度数据

我们是否使用上述步骤正确测量平均强度数据？

Answer 1

在 imageJ 中测量强度时需要注意以下几点：

1. ImageJ 自动将图像转换为 8 位
2. 如果可用，您应该始终使用 RAW
3. 如果您的显微镜无法将文件保存为 RAW 格式，您必须使用 .tif，其他格式会产生伪影
4. 如果您使用 .tif 格式，则单独保存通道而不是 RGB 堆栈

在阈值之前，您必须拆分通道，特别是如果您正在寻找来自某个波长的荧光。

您还需要在阈值之后使用“分水岭”功能，以便它会勾勒出单个单元格，从而避免勾勒出一组球形的单元格。通过这种方式，您可以测量他们的个人强度。然而，它并不完美，所以一旦 ROI 弹出并且细胞已经被粒子分析勾勒出来，您必须通过并确保它正在测量单个细胞。应删除包含多个单元格的任何大纲。还要寻找形状奇特的细胞或微核，它们也应该被删除。

现在我假设你正在测量人类癌细胞。您应该使用以下设置：

在所有这些之后，您将应用覆盖。无论您要覆盖什么图像，您还必须拆分其通道并使用包含您正在测量的波长的通道（即：Alexaflour 488 将位于 GFP 通道中）。

如果您一直在收集数据而没有这样做，我会丢弃所有数据，因为收集数据的过程并没有控制任何事情。

还有至于去哪里问这玩意。