bioinformatics - 链式特定礼帽/袖扣

Question

我有一个要组装的链特异性 RNA-seq 库（Illumina）。我想使用 TopHat/Cufflinks。从 TopHat 的手册中，它说，

“--library-type TopHat 会将读取视为链特异性。每个读取对齐都有一个 XS 属性标签。考虑在下面提供库类型选项以选择正确的 RNA-seq 协议。”

这是否意味着 TopHat 仅支持特定于链的协议？我使用选项“--library-type fr-unstred”来运行，这是否意味着它以特定于链的方式运行？我用谷歌搜索并询问了开发人员，但没有得到答案...

我得到了一些结果：

这里的 contig 由两组 reads 组装而成，左侧是反向 reads，而右侧是正向 reads。（为了可视化，我有反向补充正确的伴侣）

但是一些重叠群纯粹是由反向或正向读取组装而成的。如果它是链特异性的，一个基因应该产生相同方向的读数。它不应该像上图那样报告结果，对吗？或者是否有可能一个基因被片段化，然后独立测序，所以碰巧左边部分产生反向读取，而右边部分产生正向读取？据我了解，链特异性通过 3'/5' 连接保持，因此应该以基因为单位。

这里有什么问题？还是我错误地理解了“特定于链”的概念？任何帮助表示赞赏。

Answer 1

Tophat/Cufflinks 不用于组装，它们用于与已组装的基因组或转录组对齐。你把你的阅读与什么对齐？此外，如果您有特定于链的数据，则不应选择非链库类型。您应该根据您的文库制备方法选择合适的一种。如果您选择非链库类型，XS 标签只会放置在拆分读取上。

Answer 2

如果你想对你的转录组进行从头组装，你应该看看组装器（而不是映射器），比如

• 三位一体
• SoapDeNovo
• 绿洲……

Answer 3

Tophat 可以处理滞留库和非滞留库。在您的快照中，中心区域确实具有 + 和 - 链读取。两端的偏差可能是您的文库制备或分析方法的某些特征。这个基因的方向是什么？它看起来有点偏向左侧。如果左侧对应于 3' 末端，那么您的文库制备很可能具有 3' 偏向特征（例如 dT-primed 逆转录） 您对 RNA 进行片段化的方式也可能对您的读数分布产生影响。我想我们需要更多信息才能找到真相。但我们也应该记住，礼帽/袖扣也可能有错误。